MyBB Pro

مشاهده پروفايل کاربر

همانندسازی در یوکاریوت ها به خوبی پروکاریوت ها شناخته نشده است. تحقیقات زیادی روی موجودات آزمایشگاهی و بخصوص مخمر و سلولهای پستانداران در این زمینه انجام شده است، بسیاری از این مطالعات مشخص کرده اند که ویژگیهای کلی همانندسازی DNA در پروکاریوت ها و یوکاریوت ها شباهت های زیادی دارد. مثلا DNA هلیکازها ، توپوایزومرازها، پروتئین های باند شونده به تک رشته، پرایمازها، DNA پلی مرازها و DNA لیگازها در یوکاریوت ها نیز یافت شده اند. با وجود این همانند سازی DNA یوکاریوتی در سطح مولکولی پیچیده تر از پروکاریوت ها است. این پیچیدگی ها مرتبط با ویژگی های خاص سلولهای یوکاریوتی است. از جمله اینکه سلولهای یوکاریوتی کروموزوم های بزرگ تر و خطی دارند، کروماتین بطور محکم در نوکلئوزوم ها قرار گرفته و تنظیم سیکل سلولی خیلی پیچیده تر است.

DNA پلی مرازهای یوکاریوتی

در مورد پروتئین های درگیر در همانند سازی DNA یوکاریوتی اطلاعات زیادی در دست نیست. اما میدانیم که چندین DNA پلی مراز در این فرآیند شرکت می کنند. جدول زیر لیست بعضی از این DNAپلی مرازها و نقش احتمالی آنها را نشان می دهد.

آنزیم ها
نقش احتمالی

DNA پلی مراز α (آلفا)
سنتز پرایمر و شروع همانند سازی در هر دو رشته

DNA پلی مراز δ (دلتا)
طویل سازی (آنزیم اصلی)

DNA پلی مراز β (بتا)
ترمیم DNA

DNA پلی مراز ε (اپسیلون)
همانند سازی (آنزیم اصلی)

DNA پلی مراز γ (گاما)
همانند سازی DNA میتو کندریایی

DNA پلی مراز κ (کاپا)
برای اتصال پروتئین های کوهسین مورد نیاز است[1]

به نظر می رسید که DNA پلی مراز α رشته پیرو (lagging) را می سازد چون پیشروندگی (processivity) این آنزیم کم است. پیشروندگی یعنی اینکه یک آنزیم پلی مراز وقتی به DNA چسبید و شروع به کار کرد چه تعداد نوکلئوتید را می تواند بهم متصل کند. DNA پلی مراز III باکتری E.coli پیشروندگی بالایی دارد. زمانیکه این آنزیم روی یک رشته DNA شروع بکار می کند زمان زیادی به DNA الگو متصل می ماند و بیش از 500 هزار نوکلئوتید را پلیمریزه میکند. چونکه این آنزیم خیلی کم از رشته الگو کنده و جدا می شود سرعت کلی همانند سازی DNA در E.coli خیلی بالاست. لازم به ذکر است که هر بار که آنزیم پلی مراز از الگو کنده و جدا می شود یک وقفه پیش می آید تا آنزیم جدید متصل شود و کار را ادامه دهد. DNA پلیمرازδ دارای پیشروندگی بالاتر نسبت به DNA پلیمرازα است. لذا پیشنهاد شد که چون DNA پلی مراز α قطعات کوتاهتر DNA را می تواند بسازد، بنابراین روی رشته پیرو میتواند عمل کند که قطعات آن کوتاه تر است. با این حال امروزه مشخص شده است که تنها DNA پلیمراز یوکاریوتی که فعالیت پرایماز دارد DNA پلیمرازα می باشد و این پلی مراز، پرایمر را برای هر دو رشته بوجود می آورد. در واقع در ابتدا پرايماز يك پرايمر كوتاه به طول 12 – 8 نوكلئوتيد و از جنس RNA ميسازد و در اختيار DNA پلي مراز α قرار مي دهد. سپس اين DNA پلي مراز حدوداً 20 نوكلئوتيد از جنس DNA به آن افزوده و از DNA الگو جدا مي شود. سپس DNA پلی مراز δ و ε که پیشروندگی بالایی دارند طویل سازی دو رشته را انجام می دهند. پیشروندگی بالای DNA پلی مراز δ و ε مربوط به یک پروتئین همراه است که آنتی ژن هسته ای سلولهای تکثیر شونده (Proliferating Cell Nuclear Antigen) یا PCNA نامیده می شود. این پروتئین در سلولهای تکثیر شونده که بطور فعال DNA خود را همانند سازی می کنند به میزان زیادی وجود دارد و پیشروندگی پلی مراز را 40 برابر زیاد می کند. PCNA مانند گیره DNA پلی مراز δ یا ε را بطور فیزیکی به رشته الگو بند می کند و شبیه زیر واحد β در آنزیم DNA پلی مراز III است.

DNA پلي مراز β برعكس DNA پلي مراز δ اصلاً پیشروندگی ندارد. اين پلي مراز معمولاً يك نوكلئوتيد به رشته DNA درحال طويل شدن مي افزايد و سپس كنده مي شود. براي اضافه شدن نوكلئوتيد بعدي آنزيم پلي مراز جديدي اتصال مي يابد. اين ويژگي متناسب با نقش فرضي اين آنزيم در ترميم DNA است كه قسمت كوتاهي را مي سازد. اين قسمت كوتاه ممكن است جاهاي خالي ایجاد شده در اثر حذف پرايمر يا محل هاي برش نوكلئوتيدهاي بد جفت شده (mismatch) باشد. بعلاوه ميزان DNA پلي مراز β در يك سلول با ميزان تقسيم سلول تحت تاثير قرار نمي گيرد و اين يافته نشان مي دهد كه اين آنزيم در همانندسازي DNA دخيل نيست. چنانچه DNA پلي مراز β در همانند سازي دخيل بود انتظار داشتيم كه مانند DNA پلي مراز α و δ در سلولهاي در حال تقسيم مقدار آن زياد شود. DNA پليمراز γ در ميتوكندريها يافت مي شود و در هسته وجود ندارد. بنابراين به نظر میرسد كه مسئول همانندسازي DNA ميتوكندري باشد.

DNA پلي مرازهای دیگری نیز علاوه بر DNA پلی مرازهای فوق در سلول های یوکاریوت کشف شدهاند که نقش دقیق آنها هنوز مشخص نیست. بعضی از این DNA پلي مراز ها نقش مهمی در ترمیم DNA دارند. برخی نیز در گروه "پلیمرازهای همانندساز قسمت آسیب دیده"(lesion-replicating polymerases) قرار میگیرند. وقتی DNA پلي مرازهای α، δ یا ε با حالت غیر عادی در ساختار DNA (مثل باز های غیرعادی یا اتصال متقاطع) مواجه میشوند ممکن است قادر به همانند سازی در این مناطق نباشند. در این مواقع پلی مراز های همانند ساز قسمت آسیب دیده به DNA آسیب دیده متصل شده و با استفاده از قابلیت هایی که دارند میتوانند رشته مکمل را در این منطقه سنتز نمایند. هر آسیب خاص DNA پلی مراز خاص خود را نیاز دارد.

شروع همانندسازي در يوكاريوت ها
همانطور كه گفته شد همانندسازي يوكاريوتي بطور قابل توجهي پیچيده تر از همانندسازي باكتريايي است. اندازه بزرگتر ژنوم يك عامل مهم در پيچيده تر شدن همانندسازي يوكاريوتي است. اين موضوع همراه با حركت كندتر فاكتورهاي همانندسازي يوكاريوتي دلايلي هستند كه نشان مي دهند كروموزوم يوكاريوتي بايد چندين مبدأ همانندسازي داشته باشد. در غير اينصورت همانندسازي در زمان تخصيص داده شده كه چند دقيقه است تمام نمي شود. مشخص شده است که مخمر ساكارومايسس سروزيه 332 مبداء همانندسازي دارد كه با این حساب هر رپلیکون معادل kb 36 میباشد. در انسان تعداد مبداءهاي همانندسازی 20 هزار عدد است كه هر رپلیکون kb 150 از DNA را شامل مي شود.

تاكنون مخمرها اكثر اطلاعات ما درمورد مبداءهاي همانندسازي يوكاريوتي را فراهم نموده اند. اين موضوع تعجب برانگيز نيست چون مخمرها ساده ترين يوكاريوت ها هستند و ژنتيك مخمرها به خوبي شناسايي شده است. در سال 1979 يك توالي در DNA مخمر كشف گرديد كه مي توانست مستقل از كروموزوم هاي مخمر همانندسازي كند. اين قطعه حاوي قسمتي بود كه بعداً معلوم شد مبداء همانندسازي مخمر مي باشد. مبداءهاي همانندسازي مخمر اصطلاحاً توالي هاي همانندساز خودمختار (Autonomously Replicating Sequences) يا ARS ناميده مي شوند. يك مبداء تيپيك مخمر كوتاهتر از OriC باكتري E.coli است و معمولاً كمتر از 200 جفت باز طول دارد. اما همانند مبداء E.coli داراي قطعات مجزا با نقش هاي عملكردي متفاوت است. اين زير دامين ها (Subdomains) تواليهاي مشابهي را در مبداءهاي متفاوت دارند (شكل). در مبدا همانند سازی مخمر چهار زير دامين مشخص شده اند. دو تا از آنها يعني زير دامينهای A و B1 توالي شناسايي مبداء (Origin Recognition Sequence) را مي سازند كه 40 جفت باز طول دارد و محل اتصال كمپلكس شناسايي مبداء (Origin Recognition Gomplex) يا ORC است. ORC مجموعه اي از 6 پروتئين است كه به مبداء متصل مي شود (شكل).

ORC ها نسخه های مخمري پروتئين DnaA باكتري E.coli هستند. اما اين تفسير خيلي درست نيست چون ORCها در تمام مدت سيكل سلولي به مبداءهاي همانندسازي مخمر متصل باقي مي مانند. احتمالاً ORCها همانندسازي ژنوم را كنترل مي كنند و پروتئين شروع كننده واقعي نيستند. اين كمپلكس ها بعنوان واسطه هاي بين همانندسازي و سيگنالهاي تنظيم كننده سیکل سلولی عمل مي نمايند تا شروع همانندسازي DNA را با سيكل سلولي هماهنگ نمايند. براي شروع همانندسازي پروتئين هاي ديگري نيز به ORC اضافه مي شوند كه از آن جمله مي توان به هليكاز MCM (Minichromosome Maintenance) اشاره كرد. در مجموع در این محل کمپلکسی متشکل از بیش از 20 نوع پروتئین بوجود میآید.

در مبداءهاي همانندسازي مخمر توالي هاي ديگري نيز وجود دارد. اين تواليهاي محافظت شده زير دامينهاي B2 و B3 هستند (شكل) اطلاعات موجود نشان مي دهند كه اين دو زير دامين شبيه توالی های موجود در مبداء همانندسازي E.coli عمل مي كنند. زير دامين B2 بنظر مي رسد كه مرتبط با تكرار 13 نوكلئوتيدي مبداء E.coli است و جايي است كه دو رشته DNA براي اوّلين بار باز مي شود. در اثر اتصال يك پروتئين باند شونده به DNA بنام فاكتور-1 باند شونده به ARS (ARS Binding Factor1) يا ABF1 كه به زير دامين B3 متصل مي شود تغييري در پيچش DNA بوجود مي آيد كه باعث باز شدن دو رشته در محل زير دامين B2 مي شود (شكل). همانند باكتري E.coli به دنبال باز شدن دو رشته DNA درمبداء همانندسازي مخمر، هليكاز و آنزيم هاي ديگر همانندسازي به DNA متصل مي شوند و مرحله شروع را تكميل مي نمايند. درنهايت چنگال هاي همانندسازي بوجود آمده در طول DNA حركت كرده و همانندسازي انجام مي شود.

مشاهده پروفايل کاربر

مبداء هاي همانندسازي در يوكاريوت هاي عالي

تلاش براي شناسايي مبداء هاي همانندسازي در انسان و يوكاريوت هاي عالي تاكنون موفقيت زيادي در پي نداشته است. نواحي شروع همانندسازي توسط روشهاي گوناگوني مشخص مي شوند. مثلاً اجازه مي دهند كه همانندسازي در حضور نوكلئوتيدهاي نشاندار انجام شود. سپس فرآيند متوقف مي گردد و رشته DNA تازه ساخته شده جداسازي مي شود. با اين روش مي توان مشخص كرد كه محل اين رشته در ژنوم كجاست. آزمايشات فوق نشان مي دهند كه نواحي خاصي در كروموزوم پستانداران وجود دارد كه همانندسازي از آنجا شروع مي شود و اين نواحي نسبتاً بزرگ هستند. با اين همه مشكلات و ترديدهايي در مسير شناسايي مبداءهاي همانندسازي يوكاريوت هاي عالي وجود دارد.

مشاهده پروفايل کاربر

چنگال همانندسازي در يوكاريوت ها

مرحله طويل شدن همانند سازی در باكتريها و يوكاريوت ها اگر چه در جزئيات تفاوت دارد ولي بطور كلي مشابه است. پيشروي چنگال همانندسازي در يوكاريوت ها با فعاليت هليكاز انجام مي شود. اگر چه هنوز معلوم نيست كه كدام يك از چندين آنزيم هليكاز شناخته شده مسئول اصلي باز شدن پيچش DNA در همانندسازي است. تك رشته ها توسط پروتئين هاي باند شونده به تك رشته (Single-Strand Binding protains) به همان حالت تك رشته باقي مي مانند و نمي توانند بصورت دو رشته درآيند. مهمترين پروتئين باند شونده به تك رشته در يوكاريوت ها پروتئين همانندسازي A (Replication Protein A) يا RPA است.

DNA پلي مراز α يوكاريوتي پرايمرها را در ابتداي رشته رهبر و ابتداي قطعات اكازاكي بوجود مي آورد. DNA پلي مراز α قادر به ساخت قطعات بزرگ DNA نيست چون كه فاقد قسمت گيره (Clamp) يعني PCNA مي باشد. به همين دليل بعد از ساخت پرايمر و تقريباً20 نوكلئوتيد از DNA جاي خود را به آنزيمهای اصلي همانندسازي يعني DNA پلي مراز δ و ε مي دهد. با توجه به بعضی از مطالعات چنین به نظر می رسد که DNA پلي مراز ε سنتز رشته رهبر و DNA پلي مراز δ سنتز رشته پیرو را بر عهده دارد. ولی این فرضیه نیاز به آزمایشات بیشتری دارد. آنزيمهاي DNA پلي مراز δ و ε بر خلاف آنچه در مورد DNA پلي مراز III باكتريايي مي بينيم بصورت يك كمپلكس دايمر نيستند و دو كپي DNA پلي مراز از يكديگر جدا هستند. اتصال و جدا شدن آنزيم DNA پلي مراز δ از رشته پيرو در يوكاريوت ها توسط يك پروتئين جانبي چند زير واحدي بنام فاكتور همانندسازي C (Replication Factor C) يا RFC انجام مي شود (اين عمل در باكتريها توسط كمپلكس γ صورت مي گيرد).

همانند E.coli، تکمیل سنتز رشته هاي پيرو، نيازمند حذف پرايمر از قطعات اكازاكي است. به نظر مي رسد كه هيچ كدام از DNA پلي مرازهاي يوكاريوتي فعاليت اگزونوكلئاز '3 به '5 را ندارند تا همانند DNAپليمراز I باكتريايي پرايمر را حذف كرده و بجاي آن قطعه DNA قرار دهند. احتمالاً اين فرآيند در يوكاريوت ها متفاوت از باكتريها است. جزئي كه در اين فرآيند نقش ايفا مي كند اندونوكلئاز قطعه آويزان (Flap endonuclease) يا FEN1 است كه قبلاً MF1 ناميده مي شد. بطور طبیعی انتظار داریم که FEN1 در انتهاي'3 يك قطعه اكازاكي با كمپلكس DNA پلي مراز δ همراه شود و پرايمر قطعه اكازاكي مجاور را از انتهاي '5 تجزيه كند. البته این عمل امکانپذیر نیست زيرا FEN1 نمي تواند تجزيه پرايمر را آغاز كند. درك مطلب فوق كمي پيچيده است. پرايمر در انتهاي '5 خود گروه تري فسفات (سه فسفات) را دارد كه اين گروه باعث جلوگيري از فعاليت FEN1 مي شود (شكل). يك راه حل اين است كه RNA توسط RNase H (كه RNA را در هيبريد DNA- RNA تجزيه مي كند) حذف گردد و چون RNase H نميتواند پيوند فسفودياستر بين آخرين ريبونوكلئوتيد و اوّلين داكسي ريبونوكلئوتيد را بشكند، FEN1 وارد عمل شود و كار را تمام كند. توجه نمائيد كه آخرين ريبونوكلئوتيد ديگر گروه تري فسفات ندارد و فقط واجد '5 مونوفسفات است كه در نتيجه FEN1 قادر به حذف آن مي باشد (شكل). در اين مدل آنزيم RNase H نقش اساسي دارد. آزمايشات نشان مي دهند كه سلولهايي كه فاقد RNase H هستند نيز قادر به انجام همانندسازي رشته پيرو مي باشند. باتوجه به اين موضوع را حل ديگر براي حذف پرايمر مي تواند به اين صورت باشد كه يك هليكاز رشته پرايمر و DNA الگو را از هم جدا مي كند. پرايمر بصورت آويزان باقي مي ماند وجا براي همانندسازي آنزيم DNA پلي مراز δ باز مي شود. لذا همانندسازي تا جایي كه DNA الگو در دسترس است انجام مي شود (شكل). سپس قسمت آويزان توسط FEN1 جدا مي شود. فعاليت اندونوكلئازي FEN1 قادر است پيوند فسفودي استر را در محل انشعاب قطع كند. با توجه به اين مدل اين امكان وجود دارد كه پرايمر و كل DNA اي كه ساخته شده حذف گردد. حذف DNA ساخته شده توسط DNA پلي مراز α مهم است چون آنزيم مذكور فعاليت اگزونوكلئازي '3 به '5 ندارد و نمي تواند DNA ساخته شده را تصحیح نمايد. لذا DNA ممكن است داراي نوكلئوتيدهاي اشتباه باشد. حذف این قسمت، باعث تجدید آن توسط DNA پلي مراز δ مي شود كه خاصيت تصحيح نيز دارد.

آخرين تفاوت همانندسازي در يوكاريوت و پروكاريوت اين است كه در يوكاريوت ها هيچ معادلي براي رپليزوم باكتريها وجود ندارد[2]. در عوض آنزيم ها و پروتئين هاي دخيل در همانندسازي، ساختارهاي بزرگي در داخل هسته تشكيل مي دهند. هر ساختار شامل صدها يا هزاران كمپلكس همانندسازي منفرد است. چون اين ساختارها به ماتريكس هسته اي متصل مي باشند غير متحرك هستند. بنابراين مولكولهاي DNA از داخل اين كمپلكس ها رد مي شوند و همانندسازي مي گردند (همانند نخي كه از سوراخ سوزن رد ميشود). به اين ساختارها كارخانه هاي همانندسازي (replication factories) گفته مي شود.

--------------------------------------------------------------------------------

[1] - کروماتید های خواهری در سلول های یوکاریوتِ در حال تقسیم، به کمک پروتئین های کوهسین در کنار یکدیگر نگه داشته می شوند. این پروتئین ها بلافاصله پس از عبور چنگال همانند سازی طی روندی که احتمالا DNA پلیمراز κ در آن دخیل است به کروماتید ها می چسبند.

[2] - در باکتریها به مجموع پرایموزوم و دو DNA پلی مراز متصل به آن در چنگال همانند سازی رپلیزوم اطلاق می شود.

حالت موضوعی \| حالت خطی همانند سازی در یوکاریوت ها
نویسنده	پیام

MyBB Pro

P30-ART